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體外診斷試劑產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審評(píng)報(bào)告
產(chǎn)品中文名稱：人類10基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒 （可逆末端終止測(cè)序法）
產(chǎn)品管理類別：三類6840
申請(qǐng)人名稱： 廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司
國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局
醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心
基本信息
一、申請(qǐng)人名稱：廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司
二、申請(qǐng)人住所：廈門市海滄區(qū)鼎山路39號(hào)
三、生產(chǎn)地址：廈門市海滄區(qū)鼎山路39號(hào)
產(chǎn)品審評(píng)摘要
一、產(chǎn)品概述
（一）產(chǎn)品主要組成成分
表1 試劑盒主要組成成分
具體組成成分、配套試劑及軟件見說明書。
（二）產(chǎn)品預(yù)期用途
本試劑盒用于定性檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、結(jié)直腸癌（CRC）患者經(jīng)中性福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）的組織樣本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因變異。其中，針對(duì)NSCLC，EGFR基因中：19號(hào)外顯子缺失（19del）、L858R點(diǎn)突變用于吉非替尼片的伴隨診斷檢測(cè)，T790M點(diǎn)突變用于甲磺酸奧希替尼片的伴隨診斷檢測(cè)；ALK基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）用于克唑替尼膠囊的伴隨診斷檢測(cè)；針對(duì)CRC，KRAS基因野生型用于西妥昔單抗注射液的伴隨診斷檢測(cè)；如表2所示。
表2 伴隨診斷用途的基因變異類型及相應(yīng)的靶向藥物
表3中為本試劑盒可以檢出，但未經(jīng)伴隨診斷驗(yàn)證的基因變異類型。
表3 未經(jīng)伴隨診斷用途驗(yàn)證的基因變異類型
其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個(gè)體化治療的唯一依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。
（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格
24測(cè)試/盒
（四）產(chǎn)品檢驗(yàn)原理
本試劑盒通過構(gòu)建樣本DNA測(cè)序文庫，并使用特異探針對(duì)文庫進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲富集，捕獲后的文庫通過高通量測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因多個(gè)突變的一次性檢測(cè)。
首先，以FFPE樣本提取的DNA為材料，進(jìn)行DNA片段化處理，并使用磁珠對(duì)DNA進(jìn)行片段選擇，然后對(duì)所得片段進(jìn)行末端修復(fù)和加A處理，使用DNA連接酶將接頭連接到DNA模板的兩端，再使用帶有標(biāo)簽序列（Index）的引物和聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到擴(kuò)增文庫；擴(kuò)增文庫與帶有生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行液相雜交，并用鏈霉素包被的磁珠對(duì)與探針結(jié)合的文庫進(jìn)行捕獲富集，最后經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到捕獲文庫。捕獲文庫采用基因測(cè)序儀（型號(hào)：NextSeq CN500，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)，注冊(cè)證號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20153400460）進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)軟件判讀10種基因中是否存在來自腫瘤的變異。
二、臨床前研究摘要
（一）主要原材料
1.主要原材料的選擇
該試劑盒主要原材料包括：捕獲探針、末端修復(fù)酶、連接酶、DNA聚合酶、對(duì)照品等，這些原材料均為外購方式獲得，捕獲探針為申請(qǐng)人自行設(shè)計(jì)后由專業(yè)的合成公司合成。申請(qǐng)人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料，通過功能性試驗(yàn)，篩選出最佳原材料和供應(yīng)商。制定了各主要原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。
2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況
企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和重復(fù)性(精密度)參考品。其中：
陽性參考品共18份，包括該產(chǎn)品可檢出的所有突變或融合類型，均為DNA樣本。其中8份來自臨床樣本，5份來自混合的細(xì)胞系參考品（由自行購買的不同突變或融合類型的15個(gè)細(xì)胞系參考品混合而成），5份來自混合人工合成DNA的人類細(xì)胞系參考品（一共含18個(gè)不同突變或融合類型）。所有參考品均用Sanger測(cè)序法和數(shù)字PCR方法驗(yàn)證。
陰性參考品共8份，包括1份大腸桿菌樣本，7份試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的臨床樣本。所有樣本均用Sanger測(cè)序法和數(shù)字PCR方法驗(yàn)證為相關(guān)突變陰性。
檢測(cè)限參考品共10份，包括該產(chǎn)品可檢出的所有突變或融合類型。其中5份由混合陽性細(xì)胞系和試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系DNA稀釋獲得，5份由人工合成DNA和試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系樣本DNA稀釋獲得。10份檢測(cè)限參考品稀釋后的突變類型和重排（融合）類型變異比例為1%。
重復(fù)性參考品總共15份，包括該產(chǎn)品可檢出的所有突變或融合類型。其中7份由混合陽性細(xì)胞系和試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系DNA稀釋獲得，7份由人工合成DNA和試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系樣本DNA稀釋獲得，1份為試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系樣本DNA。12份弱陽性參考品突變比例為1～5%，2份強(qiáng)陽性參考品突變比例為15%，另采用試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的細(xì)胞系制成1份陰性參考品。
該產(chǎn)品的對(duì)照品來源于細(xì)胞系樣本的DNA，其中陽性對(duì)照品包含EGFR/KRAS基因突變陽性和ROS1基因融合，陰性對(duì)照品為試劑檢測(cè)范圍內(nèi)10種基因變異陰性，用于檢測(cè)過程中試劑和儀器的質(zhì)量控制。
（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請(qǐng)人通過對(duì)試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。
申請(qǐng)人通過使用初步確定的配方進(jìn)行反應(yīng)體系配制，對(duì)反應(yīng)體系中的樣本核酸提取試劑、末端修復(fù)試劑用量、連接試劑用量、接頭用量、LC-D7/D5引物用量、雜交文庫混合數(shù)量、雜交捕獲文庫用量、封閉劑用量、捕獲探針用量、雜交液用量、磁珠用量、雜交時(shí)間、擴(kuò)增反應(yīng)條件等進(jìn)行篩選和優(yōu)化，通過功能性試驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。
（三）分析性能評(píng)估
分析性能評(píng)估內(nèi)容包括陰/陽性參考品符合率、最低檢出限、分析特異性和干擾物質(zhì)、重復(fù)性、腫瘤組織樣本要求研究、核酸提取純化配套試劑組合性能研究等。
在陰/陽性參考品符合率試驗(yàn)中，申請(qǐng)人采用18份陽性參考品和8份陰性參考品對(duì)3批成品試劑盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果均為預(yù)期的突變型，說明陽性參考品符合率和陰性參考品符合率均為100%。同時(shí)選取21個(gè)陽性臨床樣本在3批成品試劑盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均能正確檢出。
在最低檢出限試驗(yàn)中，申請(qǐng)人采用10份檢測(cè)限參考品對(duì)3批成品試劑盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果均能正確檢出。同時(shí)選取4份經(jīng)過數(shù)字PCR定量的陽性臨床樣本（EGFR/ALK/HER2基因變異陽性，含有點(diǎn)突變、插入缺失突變和基因重排），用基因變異陰性的臨床樣本配制8級(jí)突變頻率梯度共32個(gè)樣本，每個(gè)樣本分別在3種建庫起始量（10 ng、30 ng和50 ng）下進(jìn)行了6次重復(fù)檢測(cè)，確定了樣本的檢測(cè)限為可檢測(cè)30ng DNA中頻率低至1%的突變（含有點(diǎn)突變、插入缺失突變和基因重排）。
取15份經(jīng)過數(shù)字PCR定量的陽性臨床樣本（EGFR/ALK/ROS1/HER2/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因變異陽性，含有點(diǎn)突變、插入缺失突變和基因重排），用試劑檢測(cè)范圍內(nèi)基因變異陰性的臨床樣本配制成1%變異頻率，在30ng建庫起始量下，用3批成品試劑盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）對(duì)各樣本進(jìn)行了20次重復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證，最終確定該產(chǎn)品不低于95%檢出率時(shí)，可檢測(cè)30ng DNA中頻率低至1%的突變（含有點(diǎn)突變、插入缺失突變和基因重排）。
在分析特異性試驗(yàn)中，申請(qǐng)人采用試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的基因變異陰性的臨床樣本DNA，進(jìn)行不同建庫起始量的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明產(chǎn)品對(duì)不同起始量的陰性臨床樣本DNA具有良好的耐受性。對(duì)于試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的基因變異陽性參考品，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果均為相應(yīng)型別陽性，沒有錯(cuò)檢或漏檢，說明本試劑盒能準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的堿基突變狀態(tài)，檢測(cè)的變異類型間不存在交叉反應(yīng)。本試劑盒能對(duì)非人類基因組（大腸桿菌和肺炎鏈球菌）DNA進(jìn)行正常建庫，但不能對(duì)目標(biāo)區(qū)域序列進(jìn)行捕獲富集，說明本試劑盒與非人類基因組DNA無交叉反應(yīng)。
在干擾物質(zhì)試驗(yàn)中，申請(qǐng)人在陽性臨床樣本和陰性臨床樣本中分別加入如下干擾物質(zhì)：壞死組織（等體積）、乙醇（21.7 mmol/L）、二甲苯（35 mmol/L）、蛋白酶K（0.08 mg/mL）然后進(jìn)行檢測(cè)，樣本檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期一致，說明這些干擾物質(zhì)在不高于上述濃度的情況下不會(huì)對(duì)該產(chǎn)品的結(jié)果產(chǎn)生影響。
在重復(fù)性試驗(yàn)中，申請(qǐng)人采用重復(fù)性參考品15份在3批成品試劑盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）上分別完成20次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致。同時(shí)選取了21份臨床樣本，在3批成品試劑盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分別完成20次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致。
針對(duì)核酸提取純化步驟，申請(qǐng)人采用臨床樣本，平行比較了2種核酸提取試劑盒的提取效果，根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究結(jié)果，確定了1種核酸提取試劑作為樣本提取的推薦試劑盒。
在腫瘤組織細(xì)胞含量研究中，申請(qǐng)人對(duì)不同腫瘤細(xì)胞占比對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞占比5%以上的組織樣本均可檢出。結(jié)合臨床樣本的多樣性和復(fù)雜性，建議組織樣本腫瘤細(xì)胞占比≥20%。
申請(qǐng)人提供了3批產(chǎn)品（06216070401X，06216071101X，06216071801X）在其適用機(jī)型上的性能評(píng)估資料，結(jié)果均符合要求。
（四）陽性判斷值
申請(qǐng)人首先采用少量臨床樣本進(jìn)行了初步確定，然后采用不同基因不同變異類型的陽性臨床樣本進(jìn)行陽性判斷值驗(yàn)證，最終確定了陽性判斷值標(biāo)準(zhǔn)。
申請(qǐng)人共采用了38個(gè)樣本（16個(gè)商業(yè)化參考品及22個(gè)臨床樣本；包含了點(diǎn)突變、插入/缺失和融合三種類型）進(jìn)行檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)其檢出情況。通過ROC曲線方式確認(rèn)采用突變頻率0.4%可以有效檢出突變。并對(duì)樣本原始數(shù)據(jù)分別隨機(jī)抽取測(cè)序深度為15000×、10000×、7500×、5000×，確定樣品測(cè)序平均原始深度要求為10000×，并確定了位點(diǎn)有效深度的最低要求為500×，突變絕對(duì)拷貝數(shù)應(yīng)不低于2，選擇鏈平衡性0.1～0.9作為陽性判斷值的要求（融合不適用）。
陽性判斷值驗(yàn)證：采用10份陰性、10份靈敏度參考品、以及經(jīng)數(shù)字PCR驗(yàn)證并稀釋至1%的15例FFPE樣本（包含不同基因不同區(qū)段的變異類型），分別測(cè)試陽性符合率、陰性符合率，結(jié)果表明，陽性符合率、陰性符合率都100%吻合，總體驗(yàn)證結(jié)果符合要求。
通過上述實(shí)驗(yàn)，最終確定該產(chǎn)品使用配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)的陽性判斷值為：
1.突變比例不低于0.4%；
2.測(cè)序有效深度不低于500×；
3.突變絕對(duì)拷貝數(shù)不低于2；
4.鏈平衡性介于0.1～0.9之間（融合不適用）。
（五）穩(wěn)定性研究
申請(qǐng)人對(duì)該產(chǎn)品實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品的有效保存時(shí)間。同時(shí)對(duì)石蠟樣本穩(wěn)定性、核酸（DNA）溶液穩(wěn)定性、文庫穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究，確定了檢測(cè)過程中各種樣本類型的有效保存時(shí)間。
實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究：采用三批次試劑盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）儲(chǔ)存于-20±5℃條件下，分別在0、3月、6月和8月對(duì)物理性能、準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，確定產(chǎn)品在-20±5℃條件下，可穩(wěn)定保存6個(gè)月。
運(yùn)輸穩(wěn)定性研究：采用三批試劑盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）按運(yùn)輸要求完成運(yùn)輸試驗(yàn)，然后按要求儲(chǔ)存至效期末，在運(yùn)輸前/后、儲(chǔ)存至效期末時(shí)分別對(duì)物理性能、準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，確定了該產(chǎn)品的運(yùn)輸條件。
凍融穩(wěn)定性研究：采用三批次試劑盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）反復(fù)凍融10次，分別在反復(fù)凍融第5次和10次后對(duì)物理性能、準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求。考慮到臨床實(shí)際運(yùn)用，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議凍融次數(shù)不超過5次。
開瓶穩(wěn)定性研究：采用三批次試劑盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）解凍后，拆開包裝，將末端修復(fù)緩沖液、末端修復(fù)酶、連接緩沖液、連接增強(qiáng)子、接頭、擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、LC-D5引物、LC-D7引物、封閉劑、捕獲探針、雜交緩沖液、磁珠洗滌緩沖液、5×洗滌緩沖液、聚合酶、對(duì)照品等各組分震蕩混勻、瞬時(shí)離心，在超凈工作臺(tái)中依次開蓋后再蓋緊，放置5分鐘后置于-20±5℃存儲(chǔ)（模擬使用過程），分別在第3和6個(gè)月對(duì)物理性能、準(zhǔn)確度、特異性、檢測(cè)限和精密度進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，開瓶后的試劑盒在-20±5℃保存6個(gè)月，各項(xiàng)性能指標(biāo)均滿足要求。
申請(qǐng)人對(duì)石蠟包埋樣本穩(wěn)定性、核酸（DNA）樣本凍融穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究。研究確認(rèn)石蠟組織樣本保存期限不超過18個(gè)月；核酸（DNA）樣本置于-20±5℃保存期限可達(dá)到8個(gè)月。
三、臨床評(píng)價(jià)摘要
本產(chǎn)品用于定性檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、結(jié)直腸癌（CRC）患者經(jīng)中性福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）的組織樣本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因變異。其中，針對(duì)NSCLC，EGFR基因中：19號(hào)外顯子缺失（19del）、L858R點(diǎn)突變用于吉非替尼片的伴隨診斷檢測(cè)，T790M點(diǎn)突變用于甲磺酸奧希替尼片的伴隨診斷檢測(cè)；ALK基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）用于克唑替尼膠囊的伴隨診斷檢測(cè)；針對(duì)CRC，KRAS基因野生型用于西妥昔單抗注射液的伴隨診斷檢測(cè)。
（—）比較研究
申請(qǐng)人在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院、福建省立醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院共4家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)完成了臨床試驗(yàn)。采用考核試劑與組織檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法對(duì)臨床樣本進(jìn)行比較研究，驗(yàn)證本產(chǎn)品的臨床性能。入組樣本為非小細(xì)胞肺癌樣本1248例、結(jié)直腸癌樣本295例和干擾樣本20例，共計(jì)1563例有效樣本。樣本類型均為石蠟包埋組織?？己嗽噭┡c對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本采用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
本臨床試驗(yàn)在1248例肺癌樣本中共檢出863例突變陽性樣本，陽性率為69.15%。包括EGFR基因中335例L858R突變陽性、270例Exon19 deletion突變陽性、12例T790M突變陽性、14例L861Q突變陽性、6例S768I突變陽性、8例G719A突變陽性、9例G719S突變陽性；KRAS基因中33例G12D突變陽性、33例G12C突變陽性、29例G12V突變陽性、7例G12A突變陽性、4例G12S突變陽性、2例Q61H突變陽性；NRAS基因中G12D和Q61K突變陽性各1例；BRAF基因中13例V600E突變陽性；PIK3CA基因中17例H1047R突變陽性；MET基因中檢出申報(bào)類型和非申報(bào)類型共20例MET Exon14 skipping陽性突變；HER2基因中24例A775_G776insYVMA突變陽性；ALK基因中檢出申報(bào)類型和非申報(bào)類型共85例ALK基因重排（融合）陽性； ROS1基因中檢出申報(bào)類型和非申報(bào)類型共13例ROS1基因重排（融合）陽性；RET基因中檢出申報(bào)類型和非申報(bào)類型17例RET基因重排（融合）陽性。
與對(duì)比方法的研究結(jié)果顯示，考核試劑的定性檢測(cè)結(jié)果陽性符合率為98.99%（95%CI 98.02%～99.56%），陰性符合率為82.49%（95%CI 78.69%～85.87%），總符合率為92.95%（95%CI 91.38%～94.31%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.8429，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
在1248例肺癌樣本中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致或不完全一致共有109例。109例樣本的第三方驗(yàn)證結(jié)果中，有92例與考核試劑檢測(cè)結(jié)果一致，有14例與對(duì)照方法檢測(cè)結(jié)果一致，2例（雙突變樣本）與雙方檢測(cè)結(jié)果均不一致，1例因特殊情況未進(jìn)行驗(yàn)證。
本臨床試驗(yàn)在295例結(jié)直腸癌樣本中共檢出111例突變陽性樣本，陽性率為37.63%。包括KRAS基因中45例G12D突變陽性、10例G12C突變陽性、17例G12V突變陽性、3例G12A突變陽性、3例G12S突變陽性；NRAS基因中8例G12D突變陽性、3例Q61K突變陽性、2例Q61R突變陽性；BRAF基因中13例V600E突變陽性；PIK3CA基因中9例H1047R突變陽性；1例EGFR基因G719S突變陽性；1例ROS1基因重排（融合）陽性。
與對(duì)比方法的研究結(jié)果顯示，考核試劑的定性檢測(cè)結(jié)果陽性符合率為100%（95%CI 96.38%～100%），陰性符合率為94.36%（95%CI 90.13%～97.15%），總符合率為96.27%（95%CI 93.43%～98.12%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.9190，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
在295例結(jié)直腸癌樣本中，兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致或不完全一致共有11例。11例樣本的第三方驗(yàn)證結(jié)果中，有7例與考核試劑檢測(cè)結(jié)果一致，有3例與對(duì)照方法檢測(cè)結(jié)果一致，1例（雙突變樣本）與雙方檢測(cè)結(jié)果均不一致。
（二）伴隨診斷比較研究
申請(qǐng)人在山西省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行考核試劑與伴隨診斷用途試劑的比較研究。
1.1. EGFR基因與已上市伴隨診斷試劑盒的比較研究
EGFR基因突變對(duì)比試劑采用凱杰公司therascreen®EGFR RGQ PCR Kit試劑盒。本次對(duì)比研究共納入220例福爾馬林固定，石蠟包埋的晚期非小細(xì)胞肺癌組織樣本?？己嗽噭┰?3例樣本中檢出陽性（其中19Del 41例、L858R 39例、T790M 3例、L861Q3例、S768I 1例）。
考核試劑在220例樣本中有6例樣本定性檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照試劑不一致。其中5例為考核試劑檢出陽性（其測(cè)序豐度均低于對(duì)照試劑檢出限），對(duì)照試劑檢出陰性。1例為考核試劑檢出陰性，對(duì)照試劑檢出陽性，可能原因?yàn)槟[瘤組織異質(zhì)性或檢測(cè)方法學(xué)的差異。
考核試劑與對(duì)照試劑定性檢測(cè)EGFR基因的陽性符合率為98.73%（95%CI 93.15%～99.97%），陰性符合率為96.45%（95%CI 91.92%～98.84%），總符合率為97.27%（95%CI 94.16%～98.99%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.941，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
考核試劑與對(duì)照試劑定性檢測(cè)19Del的陽性符合率為95.00%（95%CI：83.08%～99.39%），陰性符合率為98.33%（95%CI：95.21%～99.65%），總符合率為97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR L858R檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為94.74%（95%CI：82.25%～99.36%），陰性符合率為98.35%（95%CI：95.26%～99.66%），總符合率為97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR 稀有突變（包括T790M、L861Q、S768I等）檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為100.00%（95%CI：54.07%～100.00%），陰性符合率為100.00%（95%CI：98.29%～100.00%），總符合率為100.00%（95%CI：98.34%～100.00%）。
1.2. ALK基因與已上市伴隨診斷試劑盒的比較研究
ALK基因融合（重排）對(duì)比試劑采用雅培公司VysisALK Break Apart FISH 探針試劑盒和羅氏公司VENTANA ALK免疫組化（IHC）檢測(cè)試劑盒。本次對(duì)比研究共納入228例福爾馬林固定，石蠟包埋的晚期非小細(xì)胞肺癌組織樣本。228例樣本的FISH與IHC檢測(cè)結(jié)果有4例不一致，224例一致。考核試劑在224例樣本中共檢出29例陽性。
考核試劑在224例樣本中有2例樣本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照試劑不一致。1例為考核試劑檢出陽性（其測(cè)序豐度較低），對(duì)照試劑（IHC/FISH）均檢出陰性。1例為考核試劑檢出陰性，對(duì)照試劑（IHC/FISH）均檢出陽性，可能原因?yàn)槟[瘤組織異質(zhì)性或檢測(cè)方法學(xué)的差異。
考核試劑與對(duì)照試劑（IHC/FISH）定性檢測(cè)ALK基因的陽性符合率為96.55%（95%CI：82.24%～99.91%），陰性符合率為99.49%（95%CI：97.18%～99.99%），總符合率為99.11%（95%CI：96.81%～99.89%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.960，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
1.3. ROS1基因與已上市伴隨診斷試劑盒的比較研究
ROS1基因融合（重排）對(duì)比試劑采用廈門艾德生物人類ROS1基因融合檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。本次對(duì)比研究共納入232例福爾馬林固定，石蠟包埋的晚期非小細(xì)胞肺癌組織樣本。考核試劑在7例樣本中檢出陽性。
考核試劑在232例樣本中有1例樣本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照試劑不一致?？赡茉?yàn)槟[瘤組織異質(zhì)性或檢測(cè)方法學(xué)的差異。
考核試劑與對(duì)照試劑定性檢測(cè)ROS1基因的陽性符合率為87.50%（95%CI 47.35%～99.68%），陰性符合率為100.00%（95%CI 98.37%～100.00%），總符合率為99.57%（95%CI 97.62%～99.99%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.931，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
1.4.KRAS基因與已上市伴隨診斷試劑盒的比較研究
KRAS基因突變對(duì)比試劑采用凱杰公司therascreen®KRAS RGQ PCR Kit試劑盒。本次對(duì)比研究共納入204例福爾馬林固定，石蠟包埋的晚期結(jié)直腸癌組織樣本?？己嗽噭┰?8例樣本中檢出陽性。
考核試劑在204例樣本中有5例樣本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照試劑不一致。5例不一致樣本均為考核試劑檢出陽性（其測(cè)序豐度均低于對(duì)照試劑檢測(cè)限），對(duì)照試劑檢出陰性。
考核試劑與對(duì)照試劑定性檢測(cè)KRAS基因的陽性符合率為 100.00%（95%CI：94.31%～100.00%），陰性符合率為96.45%%（95%CI：91.92%～98.84%），總符合率為97.55%（95%CI：94.37%～99.20%）。進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值=0.944，P＜0.001，顯示二者具有良好的檢測(cè)一致性。
（三）TKI 藥物療效相關(guān)的回顧性臨床研究
申請(qǐng)人在上海市肺科醫(yī)院、北京胸科醫(yī)院和山西省腫瘤醫(yī)院進(jìn)行靶向藥物療效相關(guān)的回顧性臨床研究。3家研究中心合計(jì)完成162例靶向藥物療效相關(guān)研究。其中吉非替尼片53例、鹽酸?？颂婺崞?例、鹽酸厄洛替尼片2例、甲磺酸奧西替尼片25例、克唑替尼膠囊53例、西妥昔單抗注射液23例。
1.吉非替尼片藥效相關(guān)性研究
合計(jì)納入53例既往接受吉非替尼片治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性療效分析。考核試劑在53名患者治療前的石蠟包埋組織樣本中均檢出EGFR敏感突變陽性，與臨床既往分子檢測(cè)結(jié)果一致。在53名患者吉非替尼片療效評(píng)估中，38例評(píng)估部分緩解，14例評(píng)估疾病穩(wěn)定，1例評(píng)估疾病進(jìn)展，臨床用藥客觀緩解率為71.70%（95%CI 57.65%～83.21%），疾病控制率為98.11%（95%CI 89.93%～99.95%），與既往藥物臨床試驗(yàn)客觀緩解率范圍基本相符。
2.甲磺酸奧希替尼片藥效相關(guān)性研究
合計(jì)納入25例既往接受甲磺酸奧希替尼片治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性療效分析?？己嗽噭┰?5名患者治療前的石蠟包埋組織樣本中均檢出EGFR基因T790M突變陽性，與臨床既往分子檢測(cè)結(jié)果一致。在25名患者甲磺酸奧希替尼片療效評(píng)估中，16例評(píng)估部分緩解，8例評(píng)估疾病穩(wěn)定，1例評(píng)估疾病進(jìn)展，臨床用藥客觀緩解率為64%（95%CI 42.52%～82.03%），疾病控制率為96%（95%CI 79.65%～99.90%），與既往藥物臨床試驗(yàn)客觀緩解率范圍基本相符。
3.克唑替尼膠囊（ALK融合）藥效相關(guān)研究
合計(jì)納入41例既往接受克唑替尼膠囊治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性療效分析?？己嗽噭┰?1名患者治療前的石蠟包埋組織樣本中均檢出ALK基因重排（融合）陽性，與臨床既往分子檢測(cè)結(jié)果一致。在41名患者克唑替尼膠囊療效評(píng)估中，30例評(píng)估部分緩解，9例評(píng)估疾病穩(wěn)定，2例評(píng)估疾病進(jìn)展，臨床用藥客觀緩解率為73.17%（95%CI 57.06%～85.78%）、疾病控制率為95.12%（95%CI 83.47%～99.40%），與既往藥物臨床試驗(yàn)客觀緩解率范圍基本相符。
4.克唑替尼膠囊（ROS1融合）藥效相關(guān)研究
合計(jì)納入12例既往接受克唑替尼膠囊治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性療效分析?？己嗽噭┰?2名患者治療前的石蠟包埋組織樣本中均檢出ROS1重排（融合）陽性，與臨床既往分子檢測(cè)結(jié)果一致。在12名患者克唑替尼膠囊療效評(píng)估中，9例臨床評(píng)估部分緩解，3例評(píng)估疾病穩(wěn)定，臨床用藥客觀緩解率為75%（95%CI 42.81%～94.51%）、疾病控制率為100%（95%CI 73.54%～100%），與既往藥物臨床試驗(yàn)客觀緩解率范圍基本相符。 5.西妥昔單抗注射液藥效相關(guān)研究 合計(jì)納入23例既往接受西妥昔單抗注射液治療的晚期結(jié)直腸癌患者進(jìn)行回顧性療效分析?？己嗽噭┰?3名患者治療前的石蠟包埋組織樣本中的檢測(cè)結(jié)果均為KRAS基因野生型，與臨床既往分子檢測(cè)結(jié)果一致。其中10名患者為初次治療，與藥物臨床試驗(yàn)入組人群相符。在這10名患者西妥昔單抗注射液療效評(píng)估中，7例評(píng)估部分緩解，2例評(píng)估疾病穩(wěn)定，1例評(píng)估疾病進(jìn)展，臨床用藥客觀緩解率為70%（95%CI 34.75%～93.33%）、疾病控制率為90%（95%CI 55.50%～99.75%），與既往藥物臨床試驗(yàn)客觀緩解率范圍基本相符。另有11例為化療后復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌患者，治療后疾病控制率為72.73%。其他2例為維持治療。 綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗(yàn)資料對(duì)產(chǎn)品的臨床性能進(jìn)行了較全面研究，臨床試驗(yàn)符合要求。
四、收益-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
（一）收益評(píng)估
本產(chǎn)品用于定性檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、結(jié)直腸癌（CRC）患者經(jīng)中性福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）的組織樣本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因變異。其中，針對(duì)NSCLC，EGFR基因中：19號(hào)外顯子缺失（19del）、L858R點(diǎn)突變用于吉非替尼片的伴隨診斷檢測(cè)，T790M點(diǎn)突變用于甲磺酸奧希替尼片的伴隨診斷檢測(cè)；ALK基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）用于克唑替尼膠囊的伴隨診斷檢測(cè)；針對(duì)CRC，KRAS基因野生型用于西妥昔單抗注射液的伴隨診斷檢測(cè)。
本試劑盒檢測(cè)既適用于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，亦適用于結(jié)直腸癌（CRC）患者。可一次性檢測(cè)患者經(jīng)中性福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）組織樣本中的10種基因變異?；颊咄ㄟ^檢測(cè)結(jié)果可能受益于相應(yīng)的靶向藥物治療，亦可能通過檢測(cè)結(jié)果來輔助診斷，提示預(yù)后，獲得更優(yōu)的治療方案。
（二）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
本試劑盒檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到樣本來源、樣本采集過程、樣本質(zhì)量、樣本運(yùn)輸條件、樣本預(yù)處理等因素影響，同時(shí)也受到樣本DNA提取質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等限制，導(dǎo)致可能得出假陽性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果。使用者須了解檢測(cè)過程中可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)及檢測(cè)的局限性。不符合說明書中【樣本要求】的樣本和不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果，請(qǐng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書中【樣本要求】及【檢驗(yàn)方法】的要求操作和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)控。同時(shí)由于腫瘤組織可能存在較大異質(zhì)性，不同部位取樣可能會(huì)得到不同的檢測(cè)結(jié)果。本試劑盒陰性的檢測(cè)結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細(xì)胞過少、過度降解、突變類型不在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)或靶基因濃度低于檢測(cè)限亦可造成假陰性結(jié)果。 本試劑盒在檢測(cè)過程中涉及基因擴(kuò)增，在非可控的實(shí)驗(yàn)室操作可能由于環(huán)境中氣溶膠的存在導(dǎo)致結(jié)果不可靠，同時(shí)PCR操作過程中氣溶膠的泄露可能會(huì)導(dǎo)致設(shè)備甚至實(shí)驗(yàn)室的污染。因此，請(qǐng)?jiān)诳煽氐膶?shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)操作，操作人員需根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增管理辦法》進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，非專業(yè)的操作及操作不當(dāng)會(huì)影響檢測(cè)質(zhì)量。本試劑盒為基于二代測(cè)序平臺(tái)的多基因位點(diǎn)的伴隨診斷產(chǎn)品，檢測(cè)過程主要包括FFPE樣本中DNA提取、文庫制備、雜交捕獲、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析等步驟。為確保檢測(cè)全流程的質(zhì)量得到有效控制，在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)階段對(duì)樣本提取試劑、文庫質(zhì)控試劑及測(cè)序試劑進(jìn)行了全流程匹配性驗(yàn)證，為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，配套開發(fā)了測(cè)序數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判讀的生物信息分析軟件。請(qǐng)使用本試劑盒推薦使用的配套試劑盒及軟件進(jìn)行檢測(cè)，本試劑盒未對(duì)其他配套試劑盒及軟件進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。
（三）其他因素
申報(bào)產(chǎn)品對(duì)臨床疾病治療的臨床指導(dǎo)價(jià)值仍需要進(jìn)一步臨床研究。其它稀有突變本產(chǎn)品檢測(cè)試劑可以檢出，但相關(guān)腫瘤藥物安全性和有效性尚未確定。
（四）收益-風(fēng)險(xiǎn)的確定
通過在說明書等文檔中詳細(xì)規(guī)定操作流程和注意事項(xiàng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)等防范措施，對(duì)該產(chǎn)品的已知和可預(yù)見的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行控制和降低，剩余風(fēng)險(xiǎn)可以被控制在驗(yàn)收準(zhǔn)則規(guī)定的可接受范圍內(nèi)，同時(shí)沒有帶來新的危害與安全風(fēng)險(xiǎn)。考慮到風(fēng)險(xiǎn)控制措施已明確而且申報(bào)產(chǎn)品不是判斷臨床疾病的唯一依據(jù)，臨床中還應(yīng)結(jié)合患者的臨床病史、癥狀、其他診斷結(jié)果和臨床醫(yī)生的專業(yè)判斷來綜合評(píng)價(jià)臨床疾病，在權(quán)衡獲得的收益以及對(duì)臨床風(fēng)險(xiǎn)的容忍度后，申報(bào)產(chǎn)品的收益大于風(fēng)險(xiǎn)。
綜合評(píng)價(jià)意見
本申報(bào)項(xiàng)目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)，屬于創(chuàng)新審批項(xiàng)目（編號(hào)：201600077）。申請(qǐng)人的注冊(cè)申報(bào)資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院令第680號(hào)）、《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令2014 年第5 號(hào)）等相關(guān)醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)后,建議準(zhǔn)予注冊(cè)。申請(qǐng)人在該產(chǎn)品上市后應(yīng)繼續(xù)對(duì)產(chǎn)品伴隨診斷用途進(jìn)行驗(yàn)證。請(qǐng)?jiān)谥辽賰杉遗R床機(jī)構(gòu)隨訪收集伴隨診斷4 種藥物（吉非替尼片、甲磺酸奧希替尼片、克唑替尼膠囊、西妥昔單抗注射液）的臨床用藥療效隨訪數(shù)據(jù)，作為臨床補(bǔ)充資料在產(chǎn)品下一次延續(xù)注冊(cè)時(shí)提交。臨床用藥療效隨訪數(shù)據(jù)應(yīng)包括：病理診斷信息，應(yīng)用本產(chǎn)品檢測(cè)信息，患者用藥療效終點(diǎn)至最佳療效的療效數(shù)據(jù)，每種藥物相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該項(xiàng)臨床資料應(yīng)由出具數(shù)據(jù)的各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽章。
2018年11月1日
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