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2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點

一、適用范圍

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑用于對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等樣本中的2019新型冠狀病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測。本審評要點適用于進(jìn)行首次注冊申報的產(chǎn)品。

二、性能評估：

企業(yè)應(yīng)提交在符合質(zhì)量管理體系的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、實驗方案、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行靶核酸檢測前，應(yīng)有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細(xì)的驗證資料。

2.最低檢測限

（1）最低檢測限的確定

將含有2019新型冠狀病毒的真實臨床樣本/含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用樣本一致的）適當(dāng)基質(zhì)中，用于進(jìn)行最低檢測限研究，應(yīng)采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度。每個濃度梯度最少重復(fù)三次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。

在進(jìn)行最低檢測限的確定時，應(yīng)至少包括不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒樣本，進(jìn)行系列梯度稀釋。

（2）最低檢測限的驗證

選擇不同來源的至少3個病毒樣本（與最低檢測限確定不同的病毒樣本）在最低檢測限濃度水平進(jìn)行驗證，應(yīng)達(dá)到90%～95%陽性檢出率。

應(yīng)提供詳細(xì)的病毒液滴度的確定方法及驗證結(jié)果。

3.不同區(qū)域病毒樣本包容性的驗證

至少驗證包括具有時間和區(qū)域特征性的10個不同來源的病毒樣本（陽性臨床樣本或分離培養(yǎng)物），應(yīng)包括最低檢出限、重復(fù)性等性能的驗證，病毒樣本的滴度應(yīng)采用科學(xué)合理的方法進(jìn)行標(biāo)定。

4.分析特異性

（1）交叉反應(yīng)驗證包括：

①地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒；

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人間質(zhì)肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒；

肺炎支原體、肺炎衣原體；

軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌； 

煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等。

建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為10⁶ cfu/ml或更高，病毒為10⁵ pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗資料。

②人類基因組DNA。

（2）內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進(jìn)行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評價，在病毒臨界陽性水平進(jìn)行干擾試驗驗證。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物等）及在樣本采集和制備期間引入的物質(zhì)。

表1 推薦用于干擾試驗的物質(zhì)

5.精密度

企業(yè)應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應(yīng)同時包含若干臨床樣本，且精密度評價試驗應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應(yīng)對分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

（2）設(shè)定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測或者為期至少5天的檢測，具體方案可參考EP文件進(jìn)行。從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。

（3）用于精密度評價的人工模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。

①陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

②臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

③中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

6.提供企業(yè)參考品驗證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的實驗數(shù)據(jù)。

7.其他需注意問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行性能評估驗證.

三、注冊檢驗

應(yīng)提供符合產(chǎn)品技術(shù)要求的、在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進(jìn)行的產(chǎn)品檢驗報告，應(yīng)提供連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗合格報告。

該項目已有國家參考品，應(yīng)使用國家參考品進(jìn)行注冊檢驗。

四、陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對申報產(chǎn)品病毒核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進(jìn)行確認(rèn)的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應(yīng)考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。應(yīng)說明所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，閾值設(shè)置應(yīng)科學(xué)合理。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。

五、主要原材料研究資料

此產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和試驗等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實驗等。

2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。

4.試劑盒內(nèi)質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒質(zhì)控品來實現(xiàn)，其應(yīng)參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程。以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。申報資料應(yīng)對試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料詳細(xì)說明。企業(yè)應(yīng)對質(zhì)控品的檢測結(jié)果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

4.1陰性質(zhì)控品應(yīng)不含試劑盒所檢測的靶序列。

4.2陽性質(zhì)控品

陽性質(zhì)控品可用1～2個病毒株為代表，應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒）。

 5.內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增，申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針設(shè)計和模板濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內(nèi)對照的檢測結(jié)果（如Ct值）亦應(yīng)做出明確的范圍要求。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)），對待側(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

6.企業(yè)參考品

應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復(fù)性參考品。

陽性參考品應(yīng)著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來源的5個病毒樣本。

陰性參考品則主要涉及對交叉反應(yīng)的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

檢測限參考品的濃度水平可采用90～95%陽性檢出水平或略高于最低檢測限的水平，如100%陽性檢出水平。檢測限參考品的濃度確定應(yīng)科學(xué)合理。

重復(fù)性參考品建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。

申請人應(yīng)對內(nèi)部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的試驗驗證，并提交詳細(xì)的驗證資料。

六、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設(shè)置，提供相關(guān)的研究資料。

（1）研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）研究對采樣拭子及樣本保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、濃度、使用量的要求等。

4.確定最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取純度的情況下盡量擴大總反應(yīng)體系和加樣量。

5.不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對核酸分離/純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。

七、穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。

1.申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2. 適用樣本的穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入裂解液/保存液的樣本，常規(guī)病毒滅活的樣本，保存條件包括冷藏和冷凍兩種條件。如產(chǎn)品適用拭子、痰液和灌洗液等不同的樣本類型，因其中干擾物質(zhì)存在較大差異，可能對病毒RNA降解的影響不同，建議對每種樣本類型均進(jìn)行研究。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進(jìn)行評價。

對于此類試劑，如核酸提取液不能立即進(jìn)行檢測，則還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

八、臨床證據(jù)

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑臨床試驗應(yīng)按要求在三家以上臨床試驗機構(gòu)進(jìn)行（含各級疾病預(yù)防控制中心），通過考核試劑對來自臨床病例樣本的檢測結(jié)果與已上市同類產(chǎn)品檢測結(jié)果以及病例的臨床確診/排除結(jié)果進(jìn)行對比，以驗證產(chǎn)品臨床性能。已上市同類產(chǎn)品檢測結(jié)果可獲取自病例臨床診療過程。如臨床試驗機構(gòu)條件允許，推薦多家生產(chǎn)企業(yè)的試劑盒在相同的臨床試驗機構(gòu)共同驗證。

1.臨床試驗對比方法

臨床試驗應(yīng)選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比產(chǎn)品，同時，考慮考核試劑檢測結(jié)果與臨床確診/排除結(jié)果進(jìn)行對比。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診斷方案》及《全國各省（區(qū)、市）首例新型冠狀病毒感染的肺炎病例確認(rèn)程序》等文件，病例確認(rèn)方法應(yīng)依據(jù)上述文件中規(guī)定的各省份首例病例確認(rèn)程序及各省第二例及以后的感染病例的確認(rèn)程序制定。不建議采用某一試驗地點的單次試驗結(jié)果作為確認(rèn)結(jié)果。既往病例的確認(rèn)結(jié)果可提交該病例的既往確認(rèn)數(shù)據(jù)。

2.臨床試驗入組人群

臨床試驗的入組人群應(yīng)為產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為新型冠狀病毒感染肺炎的疑似病例，國家衛(wèi)生健康委在不同時間階段發(fā)布了不同版本的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，申請人在進(jìn)行臨床試驗時應(yīng)考慮當(dāng)時現(xiàn)行方案對“疑似病例”的定義，按照該定義入組病例進(jìn)行臨床研究，臨床試驗過程中應(yīng)包括確診及排除病例。臨床試驗中應(yīng)入組部分前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例，該部分病例可采用回顧性研究，臨床驗證的樣本包括：前期核酸檢測剩余樣本及病例確認(rèn)所用樣本。同時，臨床試驗還可入組部分解除隔離和符合出院標(biāo)準(zhǔn)的病例，該部分病例陰性的確認(rèn)應(yīng)滿足現(xiàn)行的《新型冠狀病毒感染的肺炎診斷方案》中關(guān)于解除隔離和出院標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3.臨床試驗樣本類型

試劑盒樣本采集建議按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》進(jìn)行。臨床試驗過程中，如臨床試驗過程中樣本確實難以獲得，經(jīng)提取后的核酸提取液亦可作為樣本進(jìn)行臨床試驗。如采用核酸提取液進(jìn)行臨床試驗，建議臨床試驗中明確該核酸提取液對應(yīng)的樣本類型及樣本保存液/采樣液（如適用），同時明確核酸提取試劑盒，臨床前應(yīng)對臨床試驗中所涉及的樣本類型、樣本保存液及核酸提取試劑進(jìn)行充分的性能評估，臨床試驗中所用樣本保存液及核酸提取試劑應(yīng)嚴(yán)格滿足考核試劑及對比試劑要求。

臨床試驗中如病例可獲得多個樣本類型，如上、下呼吸道標(biāo)本等，驗證過程中建議至少包括上呼吸道樣本和下呼吸道樣本。臨床試驗不同樣本類型及核酸提取液穩(wěn)定性應(yīng)滿足考核試劑及對比試劑的要求。

4.臨床試驗樣本量

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑為定性產(chǎn)品，臨床試驗過程樣本量應(yīng)能夠滿足評價臨床評價指標(biāo)的要求，如臨床靈敏度、臨床特異度、陰陽性符合率等，建議入組確診病例不少于200例，排除病例不少于300例，同時入組部分解除隔離和符合出院標(biāo)準(zhǔn)的病例。入組病例中不同臨床嚴(yán)重程度、不同病程階段的患者均應(yīng)有一定的例數(shù)。如申報試劑包含不同樣本類型，建議每種樣本類型單獨統(tǒng)計滿足統(tǒng)計學(xué)要求。

5.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

此類產(chǎn)品的臨床試驗?zāi)康脑谟隍炞C申報產(chǎn)品與臨床已應(yīng)用的同類產(chǎn)品及臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性，統(tǒng)計分析一般以2×2表的形式對結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計算申報產(chǎn)品與對比產(chǎn)品的符合率、臨床靈敏度、臨床特異度及其置信區(qū)間。應(yīng)將考核試劑與對比試劑檢測結(jié)果一致性及考核試劑檢測結(jié)果與臨床確認(rèn)/排除結(jié)果的一致性分別進(jìn)行統(tǒng)計分析，以評價產(chǎn)品臨床性能。

臨床試驗建議對入組人群的人口學(xué)進(jìn)行分析，包括年齡、性別、臨床診斷背景、臨床分型等。臨床試驗中應(yīng)對不同的人群進(jìn)行分層統(tǒng)計，如確診/排除病例、前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例、及解除隔離和符合出院標(biāo)準(zhǔn)病例等。針對前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例前期陰性樣本、及解除隔離和符合出院標(biāo)準(zhǔn)病例樣本，應(yīng)描述考核試劑針對新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的檢出率。臨床試驗中包含不同樣本類型的，應(yīng)在總樣本數(shù)（各樣本類型總和）進(jìn)行統(tǒng)計分析的基礎(chǔ)上，每個樣本類型分別進(jìn)行統(tǒng)計分析。

臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、疾病轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。

6. 臨床證據(jù)的形式要求

申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案和臨床試驗報告以及臨床試驗總結(jié)報告。

臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表作為臨床試驗報告的附件提交。數(shù)據(jù)表中應(yīng)包括檢測病例的編號、年齡、性別、樣本類型、臨床診斷背景信息、考核試劑檢測結(jié)果（含各基因的Ct值）、對比試劑的檢測結(jié)果（各基因的Ct值）、新冠病毒感染的確診或排除結(jié)果等，如臨床試驗中所用樣本為核酸提取液，應(yīng)明確該樣本樣本保存液（如涉及）、核酸提取試劑等。臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)集中每一病例編號應(yīng)能夠溯源。具體內(nèi)容詳見附表。

附表：