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來源：燈塔光免小助手

 

產品性能評估是產品研發(fā)、制定產品標準等過程的重要技術支持研究過程，并可能對產品的質量造成一定的影響。

 

目前國際上對體外診斷試劑的性能評估通常是以美國臨床實驗室標準化組織（Clinical and Laboratory Standards Institude以下稱為CLSI）的相關標準為依據(jù)，也是美國FDA推薦采用的評價標準。

 

美國臨床和實驗室標準協(xié)會

• CLSI是美國【臨床實驗室標準化協(xié)會】的英文縮寫，英文名為Clinical and Laboratory Standards Institute。
• CLSI前身是NCCLS【美國臨床實驗室標準化委員會】，英文名為National committee for clinical laboratory。
• 美國CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗*作方法和判斷標準，是國內臨床細菌檢驗遵循的標準。由于制訂該項標準需要投入大量的人力、財力和物力，所以大多數(shù)國家都還沒有能力建立自己的標準而依賴CLSI的方法和標準。CLSI標準每年更新！
• EP系統(tǒng)文件，在實驗室工作中常常會應用。所有這些標準和指南對制定我們臨床檢驗的標準型文件會有很大幫助。

 

性能評價的標準

體外診斷試劑產品性能評估包括檢測限、線性范圍、可報告范圍、準確度（回收實驗）、準確度（方法學比較）、精密度、干擾實驗、穩(wěn)定性、參考區(qū)間共九個項目。

Trueness / Comparability （準確度）

• EP09-A3, Method Procedure Comparison and Bias Estimation     Using Patient Samples; Approved Guideline—Third Edition
• EP15-A3, User Verification of Percision and Estimation of     Bias; Approved Guideline—Third Edition.

Precision （精密度）

• EP15-A3, User Verification of Percision and Estimation of     Bias; Approved Guideline—Third Edition.
• EP05-A3, Evaluation of Precision Performance of Quantitative     Measurement Procedures; Approved Guideline—Third Edition.

Linearity （線性）

     EP06-A, Evaluation of the Linearity ofQuantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach; ApprovedGuideline.

Limit of Detection / Quantitation （檢測限）

      EP17-A, Protocols for Determination ofLimits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline.

Reference Interval （參考區(qū)間）

EP28-A3C, Definingand Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; ApprovedGuideline—Third Edition.

Qualitative Comparability （定性可比性）

EP12-A2, User Protocol for Evaluation ofQualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

Diagnostic Accuracy （診斷準確性）

       EP12-A2, User Protocol for Evaluationof Qualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

Qualitative Precision （定性精密度）

      EP12-A2, User Protocol for Evaluationof Qualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

 

檢測限（ EP17-A ）

概述

檢測限評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據(jù)，也是產品注冊所需的重要申報資料之一。

空白限值： Limit of  Blank（ LoB ）

檢出限值：Limit of  Detection (LoD)

定量限值： Limit of  Quantitation (LoQ)

各種限值之間的關系

• 最低的是空白限值（LOB）：是不含有待測物的可能檢測的最大濃度；
• 其次低的是檢出限值（LOD）：是可能大于LOB的可被檢出的實際濃度；定量限值（LOQ）：能夠被可靠檢出的最低實際濃度。（目前接受度很低）
• LOB≤LOD ≤ LOQ
• 極限建立順序：LoB → LoD → LoQ 

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建立和驗證LoB測量程序

• ISO默認α=β=5%，5%α值相當于空白值分布的95%，作為顯著高于空白的檢測值的限值，由空白值呈正態(tài)分布，此限值相當于：

LoB=μ_B + 1.645σ_B  

注：μ_B即平均值，σ_B即SD                         

• 樣本數(shù)目：建立需要每個水平≥60個結果，驗證每個水平≥20個結果
• 正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（1）

LoB=μ_B + 1.645σ_B （1）

注：μ_B即平均值，σ_B即SD

• 偏態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（2）

LoB=PctB 100-α  （2）

樣本選擇

• 應盡可能做到，空白與低水平樣品為天然樣本，或與天然樣本具有可替換性。
• 為確保檢測具代表性，應對一組樣品作檢測，而非對單一樣品進行檢測。鑒于基體差異，最好對5個以上樣品作重復檢測。
• 作為內源性化合物，空白樣品為去除組分的樣品，如：用抗體沉淀、酶降解、活性炭吸收等
• 作為低水平內源性化合物，可使用一系列在低范圍濃度的樣品，若有必要，可配制成有分析物的樣品，最好配制一組來自不同個體的系列樣品。以綜合標準差估計來自樣品組的重復檢測變異。

建立和驗證LoD測量程序

Ø若低水平樣品檢測結果呈正態(tài)分布，其分布的5%（β）百分位數(shù)相當于LoB：

LoB=μ_S - 1.645σ_S   注：μ_s即平均值，σ_s即SD

即μ_S =LoD=LoB +1.645σ_S   ，從而            

LoD=μ_B + 1.645σ_B + 1.645σ_S                                  

• 樣本數(shù)目：建議選擇4-6個水平，建立需每個水平≥60個結果，驗證需每個水平≥20個結果
• 確定LoB后，一般認為LoD的濃度范圍近似于LoB到4倍LoB間，在此范圍內選擇一系列樣品，先測定一個實驗性的LoD_T；如果測定的SD滿足目標條件，則LoD= LoD_T，如果不滿足條件，則選擇更高的濃度重新測定。
• 正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用公式（6）

LoD_tent=LoB +c_βSD_S （6）

注：c_β=1.645/(1-1/(4*f))；f =Ns-K,即自由度

• 非正態(tài)分布數(shù)據(jù)：可嘗試轉化為正態(tài)分布，例如取對數(shù)。如無法轉換，但SD近似常數(shù)，使用公式（7）

 LoD=LoB + D _S，β （7）

注：D _S，β  類似cβ，根據(jù)β誤差范圍劃分，一般取95%的數(shù)據(jù)>LoB為置信范圍。

• 如SD不近似常數(shù)，再次選擇濃度水平反復進行實驗，直到符合上面的任何條件為止。
• 根據(jù)實際需要先確定精密度目標范圍，一般CV<20%
• 樣本數(shù)目：需要每個水平≥40個復孔結果，至少選擇3-5個樣品濃度水平，平行測定5次。驗證LoQ需要n≥25個復孔。
• 每個樣品的40個復孔總標準偏差用于建立精密度。
•  一般總誤差( Total)=偏差+2*SD_s
• 可利用合適的參考物質建立LoQ，將參考物質添加或稀釋以得到真實濃度。

舉例說明（某產品為例）

產品標準	性能考核LOB	性能考核LOD
不高于1.5U/ml	1.5U/ml	0.8U/ml（112%）
		1.2U/ml（50%）
		1.6U/ml（55%）

• 驗證LOD所用稀釋液為SeraconⅡ的血清（添加抗原）
• 驗證LOB所用稀釋液為校準品稀釋液（空白樣本）
• 樣本的制備很重要

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線性范圍

概述

• 線性范圍評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據(jù)，也是產品注冊所需的重要申報資料之一。
• 參考《EP6-A 定量測量方法的線性評價》。

基本要求

• 無論是建立或驗證線性范圍，所選用的濃度水平應可覆蓋整個預期測定范圍并包括與臨床有關的重要評價濃度，如最小測定濃度或線性范圍的最低限、不同的醫(yī)學決定水平、最大測定濃度或線性范圍的高限等。
• 目前驗證線性范圍，將測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇6個濃度水平。

實驗過程

• 建立線性范圍：需測定9-11個濃度水平，每個濃度水平重復測定3-4次。
• 驗證標稱線性參數(shù)：需測定4-6個濃度水平，每個濃度水平重復測定3-4次。

結果處理

• 依據(jù)6個樣本的實測濃度以及稀釋比例進行線性做回歸分析，計算回歸系數(shù)。
• 根據(jù)回歸方程計算6個樣本的理論濃度，計算實測濃度與理論濃度的偏差。
• 具體標準參照各試劑盒性能指標。

舉例說明（CA125）

	產品標準	性能考核
范圍	1.5U/mL～5000U/mL	1.05U/ml～6500U/mL

 

	評估資料		性能考核
	CA125-L7	定標品稀釋液	L1	L6
L1	0.1%	99.9%	100%	0%
L2	0.5%	99.5%	80%	20%
L3	5.0%	95%	60%	40%
L4	15%	85%	40%	60%
L5	30%	70%	20%	80%
L6	60%	40%	0%	100%

??

檢測值	理論值	偏差	產品標準	是否通過
6.61	-17.97	-24.58	不超過±30U/mL	是
778.9	883.3	-13.4%	不超過±15%	是
2135	2146.3	-0.53%	不超過±15%	是
3167	3309.3	-4.30%	不超過±15%	是
4679	4472	4.62%	不超過±15%	是
5602
線性相關系數(shù)r=0.9967			線性相關系數(shù)r ≥0.99	是

 

準確度

概述

準確度評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據(jù)，也是產品注冊所需的重要申報資料之一。定量檢測方法的回收實驗是評估準確度的方法之一，用于評估定量檢測方法準確測定加入純分析物的能力，結果用回收率表示。

評價依據(jù)

• 國際（或國家）標準品或自制定值樣本比對
• 準確度樣本進行回收實驗
• 臨床樣本比對

實驗過程

• 將國際（或國家）標準品或自制定值樣本稀釋成理論濃度，與實測濃度進行偏差分析
• 自制回收率樣本1和2，將1和2按照比例進行混合，得到回收率樣本3，根據(jù)實測濃度計算回收率
• 不同濃度臨床樣本40個，每天隨機選取8個樣本進行測試，持續(xù)5天，進行相關性分析

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準確度（CEA）

		回收率	產品標準
回收A	90.39	108%	85%～115%
回收B	2.55
回收C	13.85

 

	測值	定值	偏差
WHO-1	10.12	10	1.20%
WHO-2	100.1	100	0.07%

 

精密度

概述

• 精密度評價實驗的主要目的是評價獨立實驗室內的單個儀器所用的方法以及儀器的精密度。直觀的，精密度是無限制的長期使用某一儀器的變異性。通常，設計一個實驗，如果所有的因素都可以影響室內精密度評價而不用考慮每一因素或成分的相對大小，這就足夠了。描述與時間相關的精密度組成部分的名詞包括：重復性、批內精密度、日內精密度、日間精密度、室內精密度。

實驗過程

• 配置低、中、高樣本，連續(xù)進行20天重復測試，計算變異系數(shù)
• 目前KHB試劑盒質檢：重復性樣本各測試10次，計算變異系數(shù)

注意問題

• 樣品一定要穩(wěn)定，且應與新鮮的臨床病人標本性能接近，穩(wěn)定的冷凍混合血清是首選
• 樣本中的分析物含量應在該項目的醫(yī)學決定水平處，盡可能做兩個水平以上的精密度實驗
• 采用冷凍保存的樣品一定要注意內含分析物的穩(wěn)定，要嚴格控制冷凍、混勻的*作

精密度（CEA） 

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產品標準	性能考核L	性能考核M	性能考核H
CV不大于8%	4.5%	4.8%	3.4%
M樣本由L和H同體積混合而成

 

干擾實驗

概述

干擾物質是體外診斷試劑使用過程中造成測量誤差的一個主要原因，針對體外診斷試劑進行的干擾實驗是指通過實驗查找出對體外診斷試劑測量結果產生影響的物質的過程。干擾實驗評估資料是評價擬上市產品有效性的重要依據(jù)，也是產品注冊所需的重要申報資料之一

 

干擾物質來源

• 常見的異常標本，例如溶血、黃疸及脂血；
• 普通的處方藥及非處方藥；
• 患者群體中異常的生化代謝物；
• 患者群體中常見的治療藥物；
• 干擾測量程序的藥物（包括代謝物）；
• 已報道干擾相似測量程序的物質；
• 標本處理過程中的添加物，例如抗凝劑、防腐劑；
• 采集及處理過程中接觸標本的物質，例如血清分離設備、導管、標本收集容器及塞子；
•  影響某些實驗的膳食物質，例如咖啡因，β- 胡蘿卜素，罌粟籽

干擾實驗的評估

干擾物質對實驗結果的影響，一般是通過測定對照或基礎樣本池中待測物的濃度計算得出的。在某些情況下，對照樣本池中可能含有一定量的內源性干擾物質，如膽紅素、血紅蛋白、蛋白質和脂類。在一些測量程序中，采用標本前處理、樣本空白、血清基質校正物和因子校正等手段以減少這些干擾物質在平均濃度下的影響，只有當患者樣本中干擾物質濃度高于或低于平均水平時，由于干擾物質引起的誤差才會顯現(xiàn)出來。

基于此，有兩種評估干擾物質的基本方法，每一種方法都有它的優(yōu)點及內在局限性，當兩種方法同時使用時，可提供相互補充的信息。一種方法是將可疑干擾物質加入樣本以評價干擾效果，另一種方法是測量個別有代表性病人標本，相對于高特異性可比較的測量程序評價被分析測量程序產生的偏倚。 

 

實驗準備

• 基礎樣本池：從一些未服用藥物的健康個體獲得新鮮標本，以此反應標本基質。若不能獲得新鮮標本，可使用冷凍或凍干的標本代替，但應保證實驗材料充分接近新鮮臨床標本。使用適當純度的分析物將樣本池中分析物的濃度調整到醫(yī)學決定水平，但要避免引入其它的干擾物質。
• 儲存溶液：準備一種適當純度或者最接近循環(huán)形式的可疑干擾物質。制備至少20倍干擾物實驗濃度的儲存溶液。
• 評價偏倚，結果可能為正偏倚、負偏倚或無偏倚。將實驗標本與對照標本的結果比較，評價它們之間是否存在系統(tǒng)偏倚，如果存在系統(tǒng)偏倚，計算實驗組偏倚的上限與對照組的平均偏倚的差值，此值與干擾標準相比較，以評價是否存在有臨床意義的干擾。 

 

膽紅素（濃度）		血紅蛋白（濃度）
評估資料	性能考核	評估資料	性能考核
0	0	0	0
150	400	250	800
300	600	500	1000
450	800	750	1200
600		1000

 

乳糜顆粒（%）		RF（濃度）
評估資料	性能考核	評估資料	性能考核
0	0	0	0
0.25	1.00	500	800
0.50	2.00	1000	1000
1.00	3.00		1200
2.00

 

ANA（滴度）
評估資料	性能考核
0	0
80	120
160	140
	160

 

樣品名稱	終濃度	濃度值	偏差
膽紅素Ser-L1	0	10.52	／
膽紅素Ser-L2	400	12.23	16.24%
膽紅素Ser-L3	600	11.46	8.87%
膽紅素Ser-L4	800	11.33	7.69%
膽紅素Ser-H1	0	91.77	／
膽紅素Ser-H2	400	105.2	14.61%
膽紅素Ser-H3	600	99.84	8.79%
膽紅素Ser-H4	800	100.4	9.44%

 

結論

性能關乎著產品的質量，做好性能評估對于研發(fā)一個好產品來說至關重要！